蒋介石采取消极抗战积极反共的政策。
1940年4月，蒋介石主持召开国民参政会第一届第五次会议，何应钦作《冬季攻势开始以来晋冀鲁各省所发生之不幸事件》的军事报告，攻击中国共产党及其所领导的抗日武装力量“破坏行政系统，建立特殊名称”，“违背现行法令，建立特殊组织”，“利用军队，造成割据”。并叫嚷：“必照军纪，予以严厉之制裁。”
7月16日，蒋介石又提出一个所谓“提示案”，其内容有：1、拟定“陕甘宁边区”，改称“陕北行政区”，暂隶行政院，但归陕西省政府指导。
2、划定第十八集团军及新四军作战地境。将冀察战区取消，其冀察两省及鲁省黄河以北，并入第二战区，仍以阎锡山为司令长官，以朱德为副司令长官根、洛克。后者否认客观事物是经验的基础，认为经验就是，秉承军事委员会命令，指挥作战。
3、第十八集团军及新四军于奉令后1个月内，全部开到规定地区之内。
4、第十八集团军准编为3军6个师、5个补充团。新四军准编为两个师。
蒋介石的这个“提示案”的目的，是阴谋把战斗在黄河两岸和大江南北的八路军和新四军，全部赶到黄河以北贫瘠而狭窄的地区，把50万大军紧缩为10万人，然后围而歼之社会稳定和发展的保证。主要著作有与他人合著的《批判实，同时取消陕甘宁边区，从而消灭共产党及其领导的人民抗日武装力量。
战斗在大江南北的新四军发展到9万余人，建立了皖东、皖东北、豫皖苏边、苏北抗日根据地，扩大了苏南、皖中根据地。
新四军副军长项英是中央东南局书记，军长叶挺还不是共产党员，由于项英对叶挺很不尊重，使叶挺感到难以工作。毛泽东电告项英，要他与叶挺搞好关系。项英不听劝告，对叶挺处处冷遇，连中共中央的一些重要指示也不向叶挺传达。叶挺电告周恩来等，表示要辞去新四军军长职务。周恩来即致电叶挺表示挽留：“当前战役已到紧急关头，兄必须到前方督战，万万勿误。我们深知兄在工作中感觉有困难，请明告。
我们正帮助你克服这一困难。”
两个月后，叶挺离开新四军去香港。当他得知他的家乡惠州一带有共产党领导的抗日游击队——东江纵队，即找到在香港的共产党负责人廖承志，要求在粤从事游击战争，并不再坚持辞去新四军军长。尔后叶挺在香港组织起100多人奔赴东江，收编了溃散在广九铁路附近的5000粤军，开展抗日游击活动。
叶挺的离职在国民党方面引起很大反响，蒋介石对周恩来说：连叶挺都不能与你们合作，将无人与你们合作。周恩来即与毛泽东电商，将新四军的军事指挥权交给叶挺，劝叶回新四军。
叶挺来到重庆，向蒋介石表示愿回新四军工作，并同周恩来、叶剑英进行了长谈。叶挺对周恩来说：“我只因自己非党，工作困难，如加入共产党，只有去八路军工作，仍在新四军，蒋介石会怀疑我。”
周恩来亲自送叶挺去新四军军部。周对项英说道：“叶挺是个好同志，很有军事才能，这样的将领如不去团结，还要团结谁？叶挺是热爱党的事业的，热爱人民解放事业的，不能认为他现在不是党员就不欢迎他，他参加党，不如留在党外对党的工作有利得多。”
项英作了自我批评，表示要同叶挺搞好团结。
项英并未消除对叶挺的成见，叶挺的处境也未见改善。周恩来对项英十分不满，他叮嘱在重庆的新四军政治部主任袁国平马上回新四军去，如果项英再不团结叶挺，可在党内开展思想斗争，批评项英的错误。
项英是老资格的共产党人，袁国平不敢“以下犯上”，项英也未改正错误。
蒋介石提出“提示案”，遭到共产党的拒绝后，蒋介石还没有敢最后下全面反共的决心，斯大林决定给蒋介石军事援助，则促使蒋介石下了决心。
1940年9月，苏德关系日趋恶化，希特勒准备东进苏联。苏联为防止日本进攻，避免两线作战，便急于同国民党修复外交关系。斯大林认为，中国共产党在国内的地位还不巩固，力量太孱弱，还不能成为反侵略斗争的领导者，认为中国共产党的民族主义倾向相当严重，国际主义的团结感发扬不够。毛泽东永远得不到美英大国的支持，而蒋介石有美英的援助。他决定不给中国共产党援助，而电告蒋介石，决定再次向国民党提供包括150架战斗机，100架快速轰炸机，300门大炮和500辆汽车的军事援助，要求蒋介石排除对日议和的可能。
斯大林派崔可夫将军担任蒋介石政府的军事总顾问。
10月16日，蒋介石接到斯大林肯定援助的电报，摸清了苏联的底细，便决定对中国共产党进一步施加压力。10月19日，蒋介石又生一计，指使何应钦、白崇禧以国民政府军事委员会正副参谋总长名义发出皓电，致八路军朱德总司令、彭德怀副总司令和新四军叶挺军长、项英副军长，诬蔑我军“自由行动”、“自由扩军”，不听其指挥等，并限令八路军、新四军在1个月内全部开赴黄河以北。同时密令国民党第三十一集团军总司令汤恩伯率10万兵力向皖东北进攻，第二十一集团军总司令李品仙率5万兵力向皖东进攻。
早在10月初，顾祝同就开始调兵遣将，部署兵力准备围歼皖南新四军。顾先将担任对南昌方面日军防御任务的第三十二集团军总部由赣东调至魄南，又下令调驻赣东的146师、驻浙东的79师、驻苏南的40师、驻浙东的63师，以及九战区的19师进至皖南，集结待命，时刻准备围歼新四军。不久，顾祝同又命144师、52师、40师、新7师、108师等共约七八万人部队迅速向皖南新四军靠近，或封锁交通要道、或占领战略要地。并布置说：“如果新四军蓄意要挟，即予以彻底解决，防止其向黄山及天目山流窜。”国民党的广播电台，则变相地向日伪通报：“新四军要渡江北上了。”使日伪军严密地封锁了长江，并焚毁了渡船，每日派军舰在江上游弋，同时在苏南、皖南、皖东等地大举扫荡。李品仙、冷欣等部在江北、苏南布防堵击。
面对如此严重的局势，毛泽东致电在重庆的周恩来：“一面极力争取好转避免内战，一面准备应付投降应付内战，把重点放在应付投降应付内战方面，方不吃亏，方不上蒋的当。立即准备对付黑暗局面，这是全党的中心任务。有了这一着，就不会重蹈陈独秀的覆辙了。”又说：“我之方针是表面和缓，实际抵抗，有软有硬，针锋相对，缓和所以争取群众，抵抗所以保卫自己，软所以给他以面子，硬所以给他以恐怖。”
朱德、彭德怀、叶挺发出“佳电”，对“皓电”作了公开答复。对“皓电”进行了有力的驳斥，坚决拒绝了国民党要我军限期撤退到黄河以北的无理命令，同时，为了顾全团结抗日大局，采取了让步政策，表示同意将皖南新四军部队移到长江以北。
是时，皖南新四军军部和所属部队有1万余人，驻扎在安徽泾县和繁昌一带，地区狭窄，纵横不到100公里，而且北靠着日军封锁的长江、东临日伪占领区，东、西、南3方面还有国民党重兵包围。
中共中央对皖南新四军的安危极为关注。早在1940年3月，中央军委鉴于国民党有可能利用其优势兵力向新四军军部地区发起进攻，致电项英说：“军部及皖南部队应预先有所准备，以免遭到袭击。”此后，毛泽东等曾20多次电示项英，要他们认真准备北移，要有应付国民党突然袭击的准备。
但项英对国民党进攻的严重性估计不足，存在右倾错误，他一直株守皖南，等待时机。
苏联军事顾问崔可夫一行奉命来到重庆。蒋介石喜悦之情溢于言表。他在真正了解到苏联和共产国际对华政策是支持他，而非支持中国共产党，便冒险发动皖南事变。12月9日，蒋介石发出手令：“凡在长江以南的新四军，全部限本年12月31日开到长江以北地区，明年1月30日以前开到黄河以北地区。”12月10日，蒋介石密令第三战区司令长官顾祝同：“对江南匪部应按照前定计划，妥为部署并准备”该军“不遵命北渡，应立即将其解决，勿再宽容。”
毛泽东在11月和12月多次电令项英提高警惕，迅速渡江北移，并指定了北移的具体路线，严防袭击，并限令12月底全部北移完毕。但项英对蒋介石集团存有幻想，根本不相信国民党军队会对皖南新四军进攻，说顾祝同不敢进攻军部，一直按兵不动。
12月26日，毛泽东以中共中央名义致电项英、袁国平、周子昆，对他们作了严厉批评：“中央还在一年以前，即将方针给了你们，即向北发展，向敌后发展，你们却始终借故不执行，究竟你们主张的是什么？主张拖，还是主张走？似此毫无定见，毫无方向，将来你们要吃大亏的。”
鉴于情况紧张，皖南新四军部队决定以战备姿态移动。军长叶挺前往上饶，去见顾祝同，与顾交涉北移路线、军需补给以及保证北移安全等问题。叶挺同顾祝同谈了两天，最后定下：新四军开始北移时，所欠9—12月份经费当即转请补发；自4月份起尚未发给的子弹当转请补发；对在前方抗敌受伤的将士，答允予以适当的处置；北移路线：由茂林、宁国、经苏南渡江北上；移动期限：部队限1941年1月28日前撤完。兵站留守处限2月2日以前全部结束。
新四军动身前，驻泾县的国民党52师，还请新四军军部篮球队到泾县去作临别的“友谊比赛”，故意装做相安无事的样子，这是蒋介石集团在事变前策划的阴谋之一。
国民党一方面催迫新四军北移，一方面又故意刁难，不发给军需补给，不批准限定北移路线的驻地。虽然新四军领导多次交涉，仍不予解决，故意拖延时间，从而为歼灭新四军寻找借口。蒋介石命令“解决”江南新四军的密电发出后，皖南上空，顿时战云密布，一场血腥的大屠杀即将开始。
新四军进行了北移的必要准备。1700余人的北移先遣队，携重要资材1300多担，分三批移往苏南北渡。项英、袁国平、周子昆等新四军主要领导人的眷属，也随之先行。军部又把各部队共9000余人调到云岭地区，准备北移。以老一团、新一团编为第一纵队，由傅秋涛任司令员兼政委；老3团、新3团编为第二纵队，由周桂生任司令员，黄火星任政委；5团和特务团编为第三纵队，由张正坤任司令员，胡荣任政委。其余尚有军直、战地服务团和教导总队，约1000余人，随第二纵队前进。新四军军部在云岭驻了3年，部队已与当地群众结下血肉之缘。现在为了顾全抗日大局，只好委曲求全告别皖南。
1941年1月4日夜，军民依依惜别，部队里响起了《别了，三年的皖南！》的军歌：
刺刀闪光，子弹上膛，
挺起胸膛，开入敌后战场。
别了，三年的皖南！
……
新四军兵分3路，向大康王、凤村、茂林、潘村、铜山前进。那日晚上天漆黑，部队打起灯笼火把，如多条火龙，蜿蜒游动于起伏的山峦，织成奇景壮观。加上连日大雨，山径泥泞，河水陡涨，章家渡的浮桥也被冲坏，只好涉河，部队行动困难，甚为疲劳，走到5日下午，才到达茂林。
6日，蓄谋已久的蒋介石命令第三、第五战区：查朱、叶各部，尚未恪遵命令向黄河以北移动，应并用军政党综合力量迫其就范。
第三战区司令长官顾祝同接到蒋介石的命令后，于6月下午3时，命令第三十二集团军“迅速部署所部开始进剿”。第三十二集团军总司令上官云相即命令所部，以主力开始围剿茂林、铜山一带的新四军。
6日下午，新四军特务团前哨部队到达丕岭，就遭到国民党第40师的堵击。新四军军部开了紧急军事会议，决定以一纵出击求岭，二纵出击丕岭、博刀岭，三纵特务团出击高岭，5团为全军后卫。是晚，崇山峻岭中枪声四起，部队和国民党反动军展开了争夺山头的拚杀。
7日拂晓，各部队将指定的山头占领，继续前进。10时，军部越过丕岭，三个纵队，分3路会攻星潭，准备攻下星潭后，分两路向三溪敌40师师部处突围。但各部行动后，即遇到敌人碉堡的火力封锁。国民党军在1个月以前就在这些地区建筑了碉堡。当下，部队与敌人对峙激战。加上河水暴涨，水流湍急，未能攻下星潭。
此时，毛泽东、朱德致电指示叶挺、项英：“新四平在茂林不宜久留，只要宣城、宁国一带情况明了后，即宜东进，乘顽军布置未就，突过其包围线为有利。”新四军军部决定，当晚12时开始折回，经高岭向太平方向突围。
后卫的五团在高岭已同敌79师打响了，激战正酣。突围高岭未能实现。军部决定，改道由茂林方向突围。
8日夜，上官云相根据蒋介石将皖南新四军部队“一网打尽，生擒叶项”的密令，向新四军发起总攻击。军部让3团为前卫，5团为后卫向茂林方向进发。夜里，大雨滂沱，军部达高坦时，敌144师已向高坦猛攻。叶挺亲临前线指挥，激战了一夜。9日晨，叶挺仍在前线，以教导队增援3团，士气大振，激战一日，将敌144师一部击退。部队伤亡甚大。
项英试图带小部队绕道突围，派人去请叶挺商议。叶挺因在前线指挥将士们激战，项英便同袁国平一起带小部队出走。9日晚，叶挺决定率全部人员经泾县与丁家渡之间的青弋江至孤峰突围，黄昏开始行动。沿途遭到顽军的袭击，且战且走，情况十分混乱，一夜只走了20余里，于是，全军退入葫芦形横五六里的石井坑中，情况十分险恶。
叶挺和中共东南局副书记饶漱石致电毛泽东，报告部队北进又受包围，项英等去向不明等情况。尔后叶挺命令紧急集合，他站在高滩阵地上，向全军作了极其沉痛而悲愤的讲话，说：
“同志们，我们现在处于生死危急的关头，唯一的道路是杀开一条血路冲出去，我想不到蒋介石的卑鄙无耻竟到了这步田地，真是较之秦桧犹不如的中华民族的罪人。为了民族的生存，我们一定要冲出去，以挽回当前国家民族的危机，抛头颅，洒热血，在所不辞。如果我叶挺有所动摇，枪在你们手上，大家都有权打死我。”
全军将士眼含热泪高呼：“坚决突围出去！”“誓与军长共存亡！”
新四军将士形成一股不可阻挡的洪流，冲向敌人，接连从敌人那里夺下五六个山头，到了10日中午，敌144师被新四军击退，但敌79师又从144师后面增援上来，双方对峙激战到天黑。局势更加困难。
项英和袁国平于10日下午重新归队，并致电中共中央，承认错误，表示“此次行动甚坏，以候中央处罚。我坚决与部队共存亡。”同时，叶挺、项英又致电毛泽东、朱德，请党中央速向蒋、顾交涉，要其撤围。
11日，新四军继续坚守石井坑阵地，战斗更加剧烈，并打退顽军多次进攻，但终因众寡悬殊，弹粮不济，情况变得十分危急。于是，新四军军部在石井坑召开会议，检讨受挫原因，制定行动方针。在顽军40、144、79、52、108各师合围的情况下，新四军缩短防线，加强工事，以少数钳制多数，控制1个团以上强力，选择弱点，俟机突击，给以大打击后，再做第二步。叶挺向全军将士说：
“从我军长直到战士、伙夫、马夫，只要有最后一人一枪，也要和敌人拚到底。我们为了抗战与中国人民的解放，要在革命史上留下悲壮的一页。”
12日，顽军发动5个师的兵力，进行向中心合击。叶挺指挥着将士，坚守石井坑，浴血苦战。是日，中共中央致电新四军，宣布新四军由叶挺、饶漱石负责领导的决定：
1、中央决定一切军事、政治行动均由叶军长、饶漱石二人负总责，一切行动决心由叶军长下。项英同志随军行动北上。
2、中央此决定向部队干部宣布。
中央又指示：新四军“如有可能，似以突围出去分批东进或北进为有利”，“同时应注意与包围部队首长谈判”，“重庆方面，正在交涉，但你们不要靠望，一切靠你们自己”，“突围不成时，要准备打游击的计划。万一失败，要注意多保存一些干部。”
当日黄昏，石井坑周围阵地相继失守，叶挺决定分散突围。
13日凌晨，在部队突围时，袁国平壮烈牺牲。
14日，战斗更加恶化，新四军经过8昼夜的浴血奋战，终于弹尽粮绝，除傅秋涛、黄火星等2000余人突围出去外，其余7000余人，大部分壮烈牺牲。饶漱石强迫叶挺与顽军谈判。
叶挺说：
“我现在是败军之将，根本没有条件去与敌军谈判，我是坚决不能去的。”
饶漱石说：“这是军党委做出的决定，我负完全责任，我马上发电报给中央，你只管去谈判！”
叶挺无奈，只好去谈判。他一到上官云相那里，立即被非法逮捕了。
日本陆军、空军和海军，也与国民党军队配合默契，陆、水、空三管齐下，围攻新四军突围出来的零星部队。南京伪政府的绥靖部队，亦帮同协力，出动作战。新四军副军长项英和副参谋长周子昆隐蔽在泾县蜜蜂桶山密蜂洞里，于3月14日凌晨，被叛徒刘原总杀害。被俘的指战员被押送到上饶集中营，均遭惨无人道的残害。这就是震惊中外的千古奇冤——皖南事变。新四军战死和被残害计7000余人。
蒋介石干了这桩血腥勾当之后，竟于1月17日，以国民党政府军事委员会名义发出命令，宣布新四军“叛变”，已将“其全部解散”，决定“撤销”新四军番号，将叶挺交军法审判，依法惩治。而对“剿共”有功的上官云相和第二十五军则各奖赏法币5万元。同时命令汤恩伯、李品仙20余万军队大举进攻江北的新四军。
是日晚，周恩来在重庆得知国民党政府军事委员会的命令，立即打电话向何应钦提出严重抗议。他愤怒地斥责道：“你们的行动，使亲者痛，仇者快。你们作了日寇想做而做不到的事。你何应钦是中华民族的千古罪人。”
当夜，周恩来义愤填膺，亲笔手书：“为江南死国难者致哀！”“千古奇冤，江南一叶，同室操戈，相煎何急？！”翌日，周恩来将它发表在《新华日报》上。
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