基本原理
鸡胚培养法是用来培养某些对鸡胚敏感的动物病毒的一种培养方法，此方法可用以进行多种病毒的分离、培养，毒力的滴定，中和试验以及抗原和疫苗的制备等。
鸡胚培养的技术比组织培养容易成功，也比接种动物的动物来源容易，无饲养管理及隔离等的特殊要求，且鸡胚一般无病毒隐性感染，同时它的敏感范围很广，多种病毒均能适应，因此，是常用的一种培养动物病毒的方法。
各种病毒接种鸡胚均有其最适宜的途径，故应注意选择.本实验用牛痘病毒（vaccinia virus）和鸡新城疫病毒（newcastle-disease virus）接种鸡胚。牛痘病毒适宜于在绒毛尿囊膜上生长，经培养后，产生肉眼可见的白色痘疱样病变，似小结节或白色小片云翳状。鸡新城疫病毒适宜接种在尿囊腔和羊膜腔内，生长后，鸡胚全身皮肤出现出血点，以脑后最显著。
器材
牛痘病毒液，鸡新城疫病毒液；
白壳受精卵（自产出后不超过10天，以5天以内的卵为最好）；
孵卵器，检卵灯，齿钻，磨壳器，钢针，蛋座木架，注射器，2．5%碘酒，70%酒精，镊子，剪刀，封蜡（固体石蜡加 1/4凡士林，溶化），灭菌培养皿，灭菌盖玻片等。
操作步骤
1．准备蛋胚
孵育前的鸡卵先用清水以布洗净，再用干布擦干，放入孵卵器内进行孵育（37℃，相对湿度是45—60%），孵育三日后，鸡卵每日翻动1—2次。孵至第4日，用检卵灯观察鸡胚发育情况，未受精卵，只见模糊的卵黄黑影，不见鸡胚的形迹，这种鸡卵应淘汰。活胚可看到清晰的血管和鸡胚的暗影，比较大一些的可以看见胚动，随后每日观察一次，将胚动呆滞或没有运动的、血管昏暗模糊者，即可能是已死或将死的鸡胚，要随时加以淘汰。生长良好的蛋胚一直孵育到接种前，具体胚龄视所拟培养的病毒种类和接种途径而定。
2．接种
1)绒毛尿囊膜接种
(a)将孵育10—12天的蛋胚放在检卵灯上，用铅笔勾出气室与胚胎略近气室端的绒毛尿囊膜发育得好的地方。(b)用碘酒消毒气室顶端与绒毛尿囊膜记号处，并用磨壳器或齿钻在记号处的卵壳上磨开一三角形或正方形（每边约5—6mm）的小窗，不可弄破下面的壳膜。在气室顶端钻一小孔。
(c)用小镊子轻轻揭去所开小窗处的卵壳，露出壳下的壳膜，在壳膜上滴一滴生理盐水，用针尖小心地划破壳膜，但注意切勿伤及紧贴在下面的绒毛屑囊膜，此时生理盐水自破口处流至绒毛屑囊膜，以利两膜分离。
(d)用针尖刺破气室小孔处的壳膜，再用橡皮乳头吸出气室内的空气，使绒毛尿囊膜下陷而形成人工气室
(e)用注射器通过窗口的壳膜窗孔滴 0．05— 0．1ml牛痘病毒液于绒毛尿囊膜上。
(f)在卵壳的窗口周围涂上半凝固的石蜡，作成堤状，立即盖上消毒盖玻片。也可用揭下的卵壳封口，则将卵壳盖上，接缝处涂以石蜡，但石蜡不能过热，以免流入卵内。将鸡卵始终保持人工气室在上方的位置进行37℃培养，48—96小时观察结果。
(2)尿囊腔接种
用孵育10—12天的蛋胚，因这时尿囊液积存得最多。
(a)将蛋胚在检卵灯上照视，用铅笔画出气室与胚胎位置，并在绒毛尿囊膜血管较少的地方作记号。
(b)将蛋胚竖放在蛋座木架上，钝端向上。用碘酒消毒气室蛋壳，并用钢针在记号处钻一小孔。
(c)用带18mm长针头的1ml注射器吸取鸡新城疫病毒液，针头刺入孔内，经绒毛尿囊膜入尿囊腔，注入0．1ml病毒液（图Ⅻ-5）。
(d)用石蜡封孔后于37℃孵卵器孵育72小时。
(3)羊膜腔接种
(a)将孵育10—11天的蛋胚照视，画出气室范围，并在胚胎最靠近卵壳的一侧做记号。
(b)用碘酒消毒气室部位的蛋壳。用齿钻在气室顶端磨一三角形，每边约1cm的裂痕。注意勿划破壳膜。
(c)用灭菌镊子揭去蛋壳和壳膜，并滴加灭菌液体石蜡一滴于下层壳膜上，使其透明，以便观察，若将蛋胚放在检卵灯上，则看得更清楚。
(d)用灭菌尖头镊子，两页井拢，刺穿下层壳膜和绒毛尿囊膜没有血管的地方，并夹住羊膜从刚才穿孔处拉出来（图Ⅻ-6）。
(e)左手用另一把无齿镊子夹住拉出的羊膜，右手持带有26号针头的注射器，刺入羊膜腔内，注入鸡新城疫病毒液 0．1ml。针头最好用无斜削尖端的钝头，以免刺伤胚胎。
(f)用绒毛尿囊膜接种法的封闭方法将卵壳的小窗封住，于37℃孵卵器内孵育48—72小时，保持蛋胚的钝端朝上。
3．收获
(1)绒毛尿囊膜
(a)用碘酒消毒人工气室上的卵壳，去除窗孔上的盖子。
(b)将灭菌剪子插入窗内，沿人工气室的界限剪去壳膜，露出绒毛尿囊膜，再用灭菌眼科镊子将膜正中夹起，用剪刀沿人工气室边缘将膜剪下，放入加有灭菌生理盐水的培养皿内，观察病灶形状。然后或用于传代，或用50%甘油保存。
(2)尿囊腔接种法收获尿囊液
(a)将蛋胚放在冰箱内冷冻半日或一夜，使血管收缩，以便得到无胎血的纯尿囊液。
(b)用碘酒消毒气室处的卵壳，并用灭菌剪刀除去气室的卵壳。切开壳膜及其下面的绒毛尿囊膜，翻开到卵壳边上。
(c)将鸡卵倾向一侧，用灭菌吸管吸出尿囊液。一个蛋胚约可收获6ml左右尿囊液。若操作时损伤了血管，则病毒会吸附在红细胞上，尿囊液成为无用。收获的尿囊液经无菌试验后可在4℃以下的温度中保存。
(d)观察鸡胚，看有无典型的症状。
(3)羊膜腔接种法收获羊水
(a)按收获尿囊液的方法消毒、去壳，翻开壳膜和尿囊膜。(b)先吸出尿囊液。
(c)再用镊子夹出羊膜，以尖头毛细吸管插入羊膜腔，吸出羊水，放入灭菌试管内，每蛋胚可吸0．5—1．0ml。经无菌试验后，保存于低温中。
(d)观察鸡胚的症状。
写鸡新城疫病毒接种鸡胚培养后，鸡胚所出现的变化。
附： 鸡胚培养法- -
一、.实验材料
(一)7—11日龄鸡胚
(二)孵卵箱：孵卵箱要有两个，一个39℃，放正常鸡胚用，另一个33—35℃，放接种病毒后的鸡胚。
(三)照明灯，打孔器和卵盘。
(四)其它：注射器，针头，消毒剂(2.5％碘酒和75％酒精)，镊子，酒精灯，试管架，蜡和胶布等。
二、接种技术
(一)活胚检查
鸡胚使用前必须进行检查，可根据以下三方面来判断其活死：
1．血管：活胚可见明显的血管，有时可见血管搏动；死胚血管模糊，成淤血带或淤血块。
2．胎动：活胚可见明显的自然运动，尤其用手轻轻转动卵时。但胎龄大于14天胚胎，胎动则不明显，甚至无胎动；死胚见不到任何胎动，胚发红像出血样，有的呈现黑块。
3．绒毛尿囊膜发育之界线：生活良好之胚胎可见密布血管的绒毛尿囊膜与鸡胚胎的另一面形成较明显的界线。
必须把上述三方面结合起来进行观察，如果胚胎活动呆滞或不能主动地运动，血管模糊扩张或折断沉落，绒毛尿囊膜界限模糊，则可判断胚胎濒死或已经死亡。
(二)接种途径
尿囊腔接种
通常选9一11日龄鸡胚，照检后画出气室边界，在气室交界边缘以上约1mm处并避开血管作一标记此即为注射点。在点周围用先用2.5％碘酒消毒，再用75％酒精脱碘。用打孔器在注射点处打一小孔，勿损伤壳膜。用注射器注入样品0.2ml，然后用石蜡溶化封口，置33—35℃培养。于接种后24h内死亡者为非特异性死亡应弃去。
培养72h后进行收获。收获前鸡胚须置4℃冰箱6h或过夜，不能置时间过长，过长会引起散黄。如急于收获亦可置-20℃冰箱1h左右，但不能过长，过长会引起鸡胚结冰，再融化时卵黄膜就破碎，卵黄就流出。预冷的目的是，将鸡胚冻死使血液凝固，避免收获时流出红细胞并同尿液或羊水里的病毒发生凝集，造成病毒滴度下降。
收获时，用碘酒或75％酒精消毒气室部卵壳，用消毒镊子轻轻敲碎气室部卵壳并取走，再用另一无菌镊子撕去气室部壳膜，然后用无菌注射器通过绒毛尿囊膜进入尿囊腔，吸取尿囊液，置西林瓶内4℃或低温保存待用。
血凝试验
一．仪器设备：一次性注射器，微量血凝板（v型、96孔），微型振荡器，移液器
二．所需试剂：
（1）稀释液10×pbs（磷酸缓冲液ph7.0～7.2）
氯化钠8.5g，磷酸二氢钾0.68g，氢氧化钠0.15g，上述成分溶于100ml蒸馏水后高压灭菌，于4℃保存，使用时作10倍稀释。
（2）红细胞保存液（阿氏液）
葡萄糖20.5克，氯化钠4.2克，柠檬酸0.55克，柠檬酸钠8.0克 ，溶于1000毫升蒸馏水中，调ph值6.8~7.2，分装，115℃15分钟灭菌，低温保存备用。
（3）1％红细胞悬液
用一次性注射器吸取2ml阿氏液，再直接采成年公鸡翅下静脉血液2ml，混匀，转移到离心管中，用1×pbs洗涤红细胞三次，头两次以1500rpm离心5min，最后一次以2000rpm离心10min。将1ml离心压积后红细胞加入到100mlpbs中或阿氏液中即配成。
三．操作方法：
（1）于微量血凝板的每孔中滴加稀释液1×pbs 50μl，根据被检样品数量定所加排数。
（2）吸取被检尿囊液分别滴加于第一列孔，每个样品50μl，然后由左至右顺序倍比稀释至第11列孔，再从第11列孔各吸取50μl弃之。最后一列不加样品作空白对照。
（3）于每孔中加入1%红细胞悬液25μl。
（4）置微型振荡器上振荡1min，或手持血凝板绕圆圈混匀。
（5）放室温下(18～20℃)30min，观察结果。 |
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