基本原理
雞胚培養法是用來培養某些對雞胚敏感的動物病毒的一種培養方法，此方法可用以進行多種病毒的分離、培養，毒力的滴定，中和試驗以及抗原和疫苗的製備等。
雞胚培養的技術比組織培養容易成功，也比接種動物的動物來源容易，無飼養管理及隔離等的特殊要求，且雞胚一般無病毒隱性感染，同時它的敏感範圍很廣，多種病毒均能適應，因此，是常用的一種培養動物病毒的方法。
各種病毒接種雞胚均有其最適宜的途徑，故應註意選擇.本實驗用牛痘病毒（vaccinia virus）和雞新城疫病毒（newcastle-disease virus）接種雞胚。牛痘病毒適宜於在絨毛尿囊膜上生長，經培養後，産生肉眼可見的白色痘皰樣病變，似小結節或白色小片雲翳狀。雞新城疫病毒適宜接種在尿囊腔和羊膜腔內，生長後，雞胚全身皮膚出現出血點，以腦後最顯著。
器材
牛痘病毒液，雞新城疫病毒液；
白殼受精卵（自産出後不超過10天，以5天以內的卵為最好）；
孵卵器，檢卵燈，齒鑽，磨殼器，鋼針，蛋座木架，註射器，2．5%碘酒，70%酒精，鑷子，剪刀，封蠟（固體石蠟加 1/4凡士林，溶化），滅菌培養皿，滅菌蓋玻片等。
操作步驟
1．準備蛋胚
孵育前的雞卵先用清水以布洗淨，再用幹布擦幹，放入孵卵器內進行孵育（37℃，相對濕度是45—60%），孵育三日後，雞卵每日翻動1—2次。孵至第4日，用檢卵燈觀察雞胚發育情況，未受精卵，衹見模糊的卵黃黑影，不見雞胚的形跡，這種雞卵應淘汰。活胚可看到清晰的血管和雞胚的暗影，比較大一些的可以看見胚動，隨後每日觀察一次，將胚動呆滯或沒有運動的、血管昏暗模糊者，即可能是已死或將死的雞胚，要隨時加以淘汰。生長良好的蛋胚一直孵育到接種前，具體胚齡視所擬培養的病毒種類和接種途徑而定。
2．接種
1)絨毛尿囊膜接種
(a)將孵育10—12天的蛋胚放在檢卵燈上，用鉛筆勾出氣室與胚胎略近氣室端的絨毛尿囊膜發育得好的地方。(b)用碘酒消毒氣室頂端與絨毛尿囊膜記號處，並用磨殼器或齒鑽在記號處的卵殼上磨開一三角形或正方形（每邊約5—6mm）的小窗，不可弄破下面的殼膜。在氣室頂端鑽一小孔。
(c)用小鑷子輕輕揭去所開小窗處的卵殼，露出殼下的殼膜，在殼膜上滴一滴生理????水，用針尖小心地劃破殼膜，但註意切勿傷及緊貼在下面的絨毛屑囊膜，此時生理????水自破口處流至絨毛屑囊膜，以利兩膜分離。
(d)用針尖刺破氣室小孔處的殼膜，再用橡皮乳頭吸出氣室內的空氣，使絨毛尿囊膜下陷而形成人工氣室
(e)用註射器通過窗口的殼膜窗孔滴 0．05— 0．1ml牛痘病毒液於絨毛尿囊膜上。
(f)在卵殼的窗口周圍塗上半凝固的石蠟，作成堤狀，立即蓋上消毒蓋玻片。也可用揭下的卵殼封口，則將卵殼蓋上，接縫處塗以石蠟，但石蠟不能過熱，以免流入卵內。將雞卵始終保持人工氣室在上方的位置進行37℃培養，48—96小時觀察結果。
(2)尿囊腔接種
用孵育10—12天的蛋胚，因這時尿囊液積存得最多。
(a)將蛋胚在檢卵燈上照視，用鉛筆畫出氣室與胚胎位置，並在絨毛尿囊膜血管較少的地方作記號。
(b)將蛋胚竪放在蛋座木架上，鈍端嚮上。用碘酒消毒氣室蛋殼，並用鋼針在記號處鑽一小孔。
(c)用帶18mm長針頭的1ml註射器吸取雞新城疫病毒液，針頭刺入孔內，經絨毛尿囊膜入尿囊腔，註入0．1ml病毒液（圖Ⅻ-5）。
(d)用石蠟封孔後於37℃孵卵器孵育72小時。
(3)羊膜腔接種
(a)將孵育10—11天的蛋胚照視，畫出氣室範圍，並在胚胎最靠近卵殼的一側做記號。
(b)用碘酒消毒氣室部位的蛋殼。用齒鑽在氣室頂端磨一三角形，每邊約1cm的裂痕。註意勿劃破殼膜。
(c)用滅菌鑷子揭去蛋殼和殼膜，並滴加滅菌液體石蠟一滴於下層殼膜上，使其透明，以便觀察，若將蛋胚放在檢卵燈上，則看得更清楚。
(d)用滅菌尖頭鑷子，兩頁井攏，刺穿下層殼膜和絨毛尿囊膜沒有血管的地方，並夾住羊膜從剛纔穿孔處拉出來（圖Ⅻ-6）。
(e)左手用另一把無齒鑷子夾住拉出的羊膜，右手持帶有26號針頭的註射器，刺入羊膜腔內，註入雞新城疫病毒液 0．1ml。針頭最好用無斜削尖端的鈍頭，以免刺傷胚胎。
(f)用絨毛尿囊膜接種法的封閉方法將卵殼的小窗封住，於37℃孵卵器內孵育48—72小時，保持蛋胚的鈍端朝上。
3．收穫
(1)絨毛尿囊膜
(a)用碘酒消毒人工氣室上的卵殼，去除窗孔上的蓋子。
(b)將滅菌剪子插入窗內，沿人工氣室的界限剪去殼膜，露出絨毛尿囊膜，再用滅菌眼科鑷子將膜正中夾起，用剪刀沿人工氣室邊緣將膜剪下，放入加有滅菌生理????水的培養皿內，觀察病竈形狀。然後或用於傳代，或用50%甘油保存。
(2)尿囊腔接種法收穫尿囊液
(a)將蛋胚放在冰箱內冷凍半日或一夜，使血管收縮，以便得到無胎血的純尿囊液。
(b)用碘酒消毒氣室處的卵殼，並用滅菌剪刀除去氣室的卵殼。切開殼膜及其下面的絨毛尿囊膜，翻開到卵殼邊上。
(c)將雞卵傾嚮一側，用滅菌吸管吸出尿囊液。一個蛋胚約可收穫6ml左右尿囊液。若操作時損傷了血管，則病毒會吸附在紅細胞上，尿囊液成為無用。收穫的尿囊液經無菌試驗後可在4℃以下的溫度中保存。
(d)觀察雞胚，看有無典型的癥狀。
(3)羊膜腔接種法收穫羊水
(a)按收穫尿囊液的方法消毒、去殼，翻開殼膜和尿囊膜。(b)先吸出尿囊液。
(c)再用鑷子夾出羊膜，以尖頭毛細吸管插入羊膜腔，吸出羊水，放入滅菌試管內，每蛋胚可吸0．5—1．0ml。經無菌試驗後，保存於低溫中。
(d)觀察雞胚的癥狀。
寫雞新城疫病毒接種雞胚培養後，雞胚所出現的變化。
附： 雞胚培養法- -
一、.實驗材料
(一)7—11日齡雞胚
(二)孵卵箱：孵卵箱要有兩個，一個39℃，放正常雞胚用，另一個33—35℃，放接種病毒後的雞胚。
(三)照明燈，打孔器和卵盤。
(四)其它：註射器，針頭，消毒劑(2.5％碘酒和75％酒精)，鑷子，酒精燈，試管架，蠟和膠布等。
二、接種技術
(一)活胚檢查
雞胚使用前必須進行檢查，可根據以下三方面來判斷其活死：
1．血管：活胚可見明顯的血管，有時可見血管搏動；死胚血管模糊，成淤血帶或淤血塊。
2．胎動：活胚可見明顯的自然運動，尤其用手輕輕轉動卵時。但胎齡大於14天胚胎，胎動則不明顯，甚至無胎動；死胚見不到任何胎動，胚發紅像出血樣，有的呈現黑塊。
3．絨毛尿囊膜發育之界綫：生活良好之胚胎可見密佈血管的絨毛尿囊膜與雞胚胎的另一面形成較明顯的界綫。
必須把上述三方面結合起來進行觀察，如果胚胎活動呆滯或不能主動地運動，血管模糊擴張或折斷沉落，絨毛尿囊膜界限模糊，則可判斷胚胎瀕死或已經死亡。
(二)接種途徑
尿囊腔接種
通常選9一11日齡雞胚，照檢後畫出氣室邊界，在氣室交界邊緣以上約1mm處並避開血管作一標記此即為註射點。在點周圍用先用2.5％碘酒消毒，再用75％酒精脫碘。用打孔器在註射點處打一小孔，勿損傷殼膜。用註射器註入樣品0.2ml，然後用石蠟溶化封口，置33—35℃培養。於接種後24h內死亡者為非特異性死亡應棄去。
培養72h後進行收穫。收穫前雞胚須置4℃冰箱6h或過夜，不能置時間過長，過長會引起散黃。如急於收穫亦可置-20℃冰箱1h左右，但不能過長，過長會引起雞胚結冰，再融化時卵黃膜就破碎，卵黃就流出。預冷的目的是，將雞胚凍死使血液凝固，避免收穫時流出紅細胞並同尿液或羊水裏的病毒發生凝集，造成病毒滴度下降。
收穫時，用碘酒或75％酒精消毒氣室部卵殼，用消毒鑷子輕輕敲碎氣室部卵殼並取走，再用另一無菌鑷子撕去氣室部殼膜，然後用無菌註射器通過絨毛尿囊膜進入尿囊腔，吸取尿囊液，置西林瓶內4℃或低溫保存待用。
血凝試驗
一．儀器設備：一次性註射器，微量血凝板（v型、96孔），微型振蕩器，移液器
二．所需試劑：
（1）稀釋液10×pbs（磷酸緩衝液ph7.0～7.2）
氯化鈉8.5g，磷酸二氫鉀0.68g，氫氧化鈉0.15g，上述成分溶於100ml蒸餾水後高壓滅菌，於4℃保存，使用時作10倍稀釋。
（2）紅細胞保存液（阿氏液）
葡萄糖20.5剋，氯化鈉4.2剋，檸檬酸0.55剋，檸檬酸鈉8.0 ，溶於1000毫升蒸餾水中，調ph值6.8~7.2，分裝，115℃15分鐘滅菌，低溫保存備用。
（3）1％紅細胞懸液
用一次性註射器吸取2ml阿氏液，再直接采成年公雞翅下靜脈血液2ml，混勻，轉移到離心管中，用1×pbs洗滌紅細胞三次，頭兩次以1500rpm離心5min，最後一次以2000rpm離心10min。將1ml離心壓積後紅細胞加入到100mlpbs中或阿氏液中即配成。
三．操作方法：
（1）於微量血凝板的每孔中滴加稀釋液1×pbs 50μl，根據被檢樣品數量定所加排數。
（2）吸取被檢尿囊液分別滴加於第一列孔，每個樣品50μl，然後由左至右順序倍比稀釋至第11列孔，再從第11列孔各吸取50μl棄之。最後一列不加樣品作空白對照。
（3）於每孔中加入1%紅細胞懸液25μl。
（4）置微型振蕩器上振蕩1min，或手持血凝板繞圓圈混勻。
（5）放室溫下(18～20℃)30min，觀察結果。 |
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