| | 金黃色葡萄球菌是臨床上常見的毒性較強的細菌，自從本世紀40年代青黴素問世後，金黃色葡萄球菌引起的感染性疾病受到較大的控製，但隨着青黴素的廣泛使用，有些金黃色葡萄球菌産生青黴素酶，能水解β-內酰胺環，表現為對青黴素的耐藥。因而人們又研究出一種新的能耐青黴素酶的半合成青黴素，即甲氧西林(methicillin)。1959年應用於臨床後曾有效地控製了金黃色葡萄球菌産酶株的感染，可時隔兩年，英國的jevons［1］就首次發現了耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(methicillin resistant staphylococcus aureus,mrsa),mrsa從發現至今感染幾乎遍及全球，已成為院內感染的重要病原菌之一。因此，開展對mrsa的檢測，對於控製醫院內感染的流行，指導臨床治療有着十分重要的意義。
mrsa的特性
1不均一耐藥性［2］mrsa菌落內細菌存在敏感和耐藥兩個亞群，即一株mrsa中衹有一小部分細菌約10－4～10－7，對甲氧西林高度耐藥，在50 μg/ml甲氧西林條件下尚能生存，而菌落中大多數細菌對甲氧西林敏感，在使用抗生素後的幾小時內大量敏感菌被殺死，但少數耐藥菌株卻緩慢生長，在數小時反又迅速增殖。
2廣譜耐藥性mrsa除對甲氧西林耐藥外，對其它所有與甲氧西林相同結構的β-內酰胺類和頭孢類抗生素均耐藥，mrsa還可通過改變抗生素作用靶位，産生修飾酶，降低膜通透性産生大量paba等不同機製［3］，對氨基糖苷類、大環內酯類、四環素類、氟喹喏酮類、磺胺類、利福平均産生不同程度的耐藥，唯對萬古黴素敏感。
3生長特殊性mrsa生長緩慢，在30°c，培養基ph 7.0及高滲(40 g/l nacl溶液)條件下生長較快［4］。在30°c時，不均一耐藥株表現為均一耐藥和高度耐藥，在37°c又恢復不均一耐藥。均一耐藥株在＞37°c或ph＜5.2時，均一耐藥性可被抑製而表現為敏感。增加nacl濃度，低溫孵育和延長時間，可使不均一耐藥株群體中敏感亞群中的耐藥性得到充分表達，即能耐受較高濃度的甲氧西林，而對其中耐藥亞群無影響［5］。但最近也有報道，高滲下延長培養時間，會影響mrsa的檢出結果，因為在高????情況下，培養48 h，對甲氧西林敏感的金黃色葡萄球菌(methicillin sensitive staphylococcus aureus;mssa)易産生大量β-內酰胺酶，可緩慢水解甲氧西林，導致細菌生長，而誤認為mssa。所以一般mrsa在高????環境孵育24 h，而耐甲氧西林凝固酶陰性葡萄球菌(mrcns)由於耐藥亞群菌數少於金葡菌，應孵育48小時觀察結果。
mrsa的耐藥機理
1固有耐藥是由染色體介導的耐藥，其耐藥性的産生與細菌産生一種青黴素結合蛋白(pbp)有關。産生五種pbp(1，2，3，3′和4)，它們具有合成細菌細胞壁的功能。它們與β-內酰胺類抗生素有很高的親和力，能共價結合於β-內酰胺類藥物的活動位點上，失去其活性導致細菌死亡，而mrsa産生了一種獨特的pbp，這種分子量增加了78～1000道爾頓的pbp，因其電泳率介於pbp2與pbp3之間，故稱為pbp2a或pbp2′［6］。pbp2a對β-內酰胺類抗生素親和力很低，因而很少或不被β-內酰胺類藥結合。在β-內酰胺類抗生素存在的情況下，細菌仍能生長，表現出耐藥性。pbp2a的産生是受染色體甲氧西林耐藥基因(mec a)來調節的。mrsa與mssa根本區別在於它們的pbp不同。
2獲得性耐藥是質粒介導的耐藥。某些菌株通過耐藥因子産生大量β-內酰胺酶，使耐酶青黴素緩慢失活，表現出耐藥性［7］，多為臨界耐藥。
mrsa的分型
mrsa分型對追蹤傳染源，研究型別與感染種類，耐藥性的關係有重要作用。國外開展較早的噬菌體分型，將待測菌於肉湯中，35°c孵育6 h，塗於分型瓊脂平板上，待幹後將23種噬菌體註入瓊脂平板中的小方格內，再置35°c孵育6 h後移至室溫過夜觀察結果。用4組23種噬菌體，將mrsa分為4群，一般以Ⅰ群為最多［8］，也有報告以Ⅲ群為多。噬菌體分型結果常不滿意，日本小粟子證實有29.3%菌株不能分型，且重複性差，不宜用於流行病學調查。質粒圖譜分型較為可靠，可分為18個型，能準確地分析菌株之間的相關性，將流行菌株與非流行菌株加以區別。國內mrsa廣泛存在分子量為1.6 md、1.8 md及2.67 md的質粒，不同地區和不同醫院會有特殊質粒帶。免疫印跡分型法將mrsa分為9個型，以b、c型為最常見，各型含有特徵性的分子帶，該法比較穩定。染色體限製性內切酶分析可識別病原體dna鏈上特異位點及核苷酸序列，能從基因水平顯示病原體特徵，mrsa還可用血清學、凝固酶、耐藥譜等方法分型。現在southern印跡法也逐漸運用於mrsa的分型。
mrsa的檢測
由於mrsa的不均一耐藥性，給其檢測帶來一定的睏難。mrsa的檢出率受孵育溫度、時間、培養基的ph和nacl的濃度、菌液的數量等多種因素的影響。因此，目前還沒有一種最佳的檢測方法。
1紙片擴散法(k-b法)平皿中mh瓊脂厚度為4 mm，菌液調至0.5麥氏濁度，塗沫於上述平板，甲氧西林含量5 μg/片，35°c孵育24 h，抑菌圈≤11 mm為耐藥，≥17 mm為敏感，由於mrsa通常對其它耐酶半合成青黴素也耐藥，因此美國臨床實驗室標準化委員會(nccls)推薦用苯唑西林來代替檢測mrsa。苯唑西林在貯存過程中藥效不易降低，且對不均一耐藥性檢測效果更好，所以國內多數實驗室都采用苯唑西林，苯唑西林含量為1 μg/片，抑菌圈≤10 mm為耐藥，≥13 mm為敏感，11～12 mm為中介。質控菌株為金黃色葡萄球菌atcc 29213(耐藥菌株)，金黃色葡萄球菌atcc 25923(敏感菌株)。紙片擴散法最大優點是快速、簡便、價格便宜，易被檢驗人員接受。在合適的抗生素及培養溫度、菌液的濃度、培養基厚度等條件下，檢測mrsa是可行的。但leneastre等［9］對k-b法和特異性mec a基因dna片段法鑒定mrsa的結果進行了比較，發現在49株用k-b法鑒定為mssa的菌株，特異性mec a基因dna片段法鑒定卻有11株含mec a基因；59株用紙片法鑒定為典型mrsa的菌株，有10株卻沒有特異性mec a基因，這兩種方法大約有18%～20%的差異。chipman［10］等研究也表明以mec a基因檢測法為參考方法時，紙片擴散法的符合率為88.2%。這可能與紙片法中的瓊脂中沒有nacl成份，一些菌株的耐藥性得不到完全表達有關。因此，為提高紙片擴散法檢測mrsa的可靠性，最好在mh瓊脂中加入40 g/l nacl。
2肉湯稀釋(mic)法美國疾病控製中心(cdc)推薦用mh肉湯培養基加nacl至20 g/l濃度，同時加入ca,mg離子，將苯唑西林進行倍比稀釋，從0.125～16 μg/ml，菌濃度為104/ml，35°c孵育24 h，mic＜2 μg/ml為敏感，＞4 μg/ml為耐藥，該法檢出率可達95%，但操作較繁瑣。
3瓊脂稀釋(mic)法用含20 g/l nacl的mh瓊脂將苯唑西林倍比稀釋為12個不同濃度並澆註平皿。苯唑西林量終濃度為0.125～256 μg/ml。再將菌液(0.5麥氏濁度)點種於含藥平皿，35°c孵育24 h。該法適用於大量菌株的mrsa檢測，結果容易判斷，重複性好，但耗時，費力。
4瓊脂篩選法這是1997年nccls推薦的mrsa的確證試驗，即mh培養基加nacl(40 g/l)加苯唑西林(6 μg/ml)，將菌液(0.5麥氏濁度)點種或畫綫35°c孵育24 h，衹要平皿有菌生長，即使一個菌落也是mrsa，該法敏感度為100%，常用作校正其它方法的標準，尤其適用於檢測抑菌圈直徑處於中介度的金黃色葡萄球菌。
5濃度梯度(etest)法是1988年ab biodisk公司推出，在含20 g/l nacl的mh瓊脂平板上，貼上苯唑西林的試條，菌液調至0.5～1麥氏濁度，35°c孵育24 h，直接讀取mic值。mic＜2 μg/ml為敏感，＞4 μg/ml為耐藥。etest法結合了紙片擴散法和肉湯稀釋法的優點，長塑料條含有連續的呈指數梯度變化的苯唑西林(0.016～256 μg/ml)，故在檢測低水平或中等程度耐藥的mrsa時結果更為準確。novak［11］等報道，用alamar法和etest法對127株mrsa的檢測比較，兩者結果相關較高，用etest法檢測127株mrsa，其中93株mic＞256 μg/ml，28株在6～256 μg/ml，檢出率達96%，etest法具有精確、可靠、穩定性好的特點，但缺點是價格昂貴。
6自動化藥敏檢測目前有vitek係統、atb係統、microscan係統、sensiter aris等。將菌液稀釋後註入藥敏板或孔內，然後通過檢測菌液濁度，熒光指示劑的熒光強度或熒光底物的水解反應來判讀結果。其優點是快速，但有時對生長緩慢或延遲表達耐藥性的mrsa，在3～4 h內難以達到檢測水平，容易漏檢或誤報mrsa。
7dna探針雜交上述的方法都是檢測mrsa耐藥表型的方法。mrsa根據其耐藥頻率可分為1、2、3、4類，其耐藥頻率為10－7、10－4、10－3以及10－1［12］。上述常規的檢測方法對於3、4類mrsa一般不存在問題，但對於低頻率的1、2類則很容易造成漏檢。因此，對於低水平耐藥或臨界水平耐藥的mrsa，應選擇特異性高的分子生物學方法來檢測。dna探針雜交是用特異性的mec a dna片段經地高辛標記，與可疑菌株進行雜交，有學者報告［13］，dna探針僅與mrsa dna雜交，與mssa dna無雜交帶，其特異性高於瓊脂稀釋法，敏感性高於肉湯稀釋法，而且可直接用於臨床標本，無需先進行細菌分離培養，但探針較貴，保存期較短。
8pcr技術本世紀80年代末期，國外就有人用聚合酶鏈反應(pcr)來檢測pbp2a的mec a基因。它是根據金黃色葡萄球菌tk 784的mec a基因dna序列［14］設計一引物，再裂解提取被測菌的dna，在一定條件下進行擴增，經瓊脂糖電泳後在紫外燈下觀察有無與陽性對照菌株(金黃色葡萄球菌atcc29213)相同的區帶。pcr具有較高的靈敏度，衹要被測菌有微量的的基因，即出現陽性結果，因此常作為檢測mrsa的參考方法。陳秀樞實驗表明［14］，金黃色葡萄球菌耐苯唑西林的耐藥水平與mec a基因有較好的相關性。mic＞4 μg/ml的22株菌均檢出mec a基因。由於pcr很靈敏，有時會因實驗室的污染而出現假陽性，為使pcr具有更高的可靠性，必須對其擴增産物進行探針雜交或測序以提高特異性［15］。而有一些耐藥基因是沉默基因，不表達mec a基因産物，有時會得出假耐藥結論，所以分子生物學方法並非100%的敏感和特異，加上該法前期處理操作繁瑣，且需要一定的設備，僅在可疑或特殊情況下做此試驗。
mrsa感染的流行概況
自從1961年英國發現mrsa後，在歐美及亞洲一些國傢相繼報道了mrsa所致的院內感染。從60年代後期到80年代，mrsa感染率大大增加。美國nnis報道1975年182所醫院mrsa占金黃色葡萄球菌感染總數的2.4%，1991年上升至24.8%，其中尤以500張床以上的教學醫院和中心醫院為多，因為這些醫院裏mrsa感染的機會較多，耐藥菌株既可由感染病人帶入醫院，也可因濫用抗生素在醫院內産生［16］。歐洲1993年1417傢醫院icu分離的mrsa達60%［17］。而日本kansai醫科大學附屬醫院mrsa的分離率1993年達到41%。國內在70年代發現有mrsa，近幾年mrsa的檢出率正在逐年上升，上海1978年在200株金黃色葡萄球菌中mrsa衹占5%，1988年上升至24%，1996年激增至72%［18］。天津1988年調查mrsa分離率為47%［19］，北京醫科大學附屬醫院1996年分離mrsa達58.3%［20］，山東淮坊市1996年在三傢醫院的嬰兒室分離出金黃色葡萄球菌198株，其中mrsa為112株(56.5%)［21］。武漢同濟醫科大學附院1992年分離mrsa就達79.6%［22］。mrsa感染多發生於免疫缺陷者，大面積燒傷，大手術後患者，長期住院及老年患者，mrsa極易導致感染的流行和暴發。mrsa傳播主要通過醫護人員的手，在患者、醫護人員、患者間播散，另外，衣物、敷料等物品可攜帶mrsa，促進mrsa在院內的流行，病人一旦感染或攜帶mrsa，該菌可存在於患者身上達數月之久。
mrsa的治療和預防
1mrsa的治療mrsa感染的治療是臨床十分棘手的難題之一，關鍵是其對許多抗生素有多重耐藥，萬古黴素是目前臨床上治療mrsa唯一療效肯定的抗生素［23］。應用30多年來未發現耐藥菌株。因為萬古黴素是三環糖肽類抗生素，其具有抑製細胞壁合成，破壞細胞膜及阻礙細菌rna合成的多種作用。1996年日本報道第一例對萬古黴素中度敏感(mic=8 μg/ml)的金黃色葡萄球菌。1997年美國也從一個腹膜炎患者分離出對萬古黴素中度敏感的金黃色葡萄球菌［24］。nccls規定：萬古黴素敏感≤4 μg/ml，中介8～16 μg/ml，耐藥≥32 μg/ml，而世界上到目前為止還未檢測到一株mic＞32 μg/ml的金黃色葡萄球菌。但是隨着萬古黴素的廣泛使用，相信不久就會出現耐萬古黴素的mrsa，因此現在就必須適量地慎用萬古黴素。除萬古黴素外，還有壁黴素、香豆黴素等新藥對mrsa有較強的抗菌活性。另外，萬古黴素也可與磷黴素、利福平、氨基糖苷類、喹諾酮類藥物合用，加強治療效果。
2mrsa預防首先是合理使用抗生素。目前臨床濫用抗生素的現象，對mrsa的流行起了一定的擴散作用，因此，在選擇抗生素時應慎重，以免産生mrsa菌株，如對大手術後預防深部葡萄球菌感染，使用第一代和第二代頭孢菌素為好(如頭孢唑啉、頭孢呋肟等)，第三代頭孢菌素抗葡萄球菌效果反而不如第一代效果好。第三代頭孢菌素的長期使用與mrsa的出現率呈平行關係。
3早期檢出帶菌者醫院應加強對新入院及mrsa易感者的檢查，尤其是燒傷病區、icu、呼吸病房、血液科和小兒科的病人。同時細菌室應選用準確的檢測手段，發現mrsa，及時嚮臨床報告，以便控製感染和隔離治療。
.4加強消毒制度醫護人員檢查病人前後要嚴格洗手消毒，有條件應用一次性口罩、帽子、手套，醫療用品要固定，以防院內交叉感染。 | | 金黃色葡萄球菌是臨床上常見的毒性較強的細菌，自從本世紀40年代青黴素問世後，金黃色葡萄球菌引起的感染性疾病受到較大的控製，但隨着青黴素的廣泛使用，有些金黃色葡萄球菌産生青黴素酶，能水解β-內酰胺環，表現為對青黴素的耐藥。因而人們又研究出一種新的能耐青黴素酶的半合成青黴素，即甲氧西林(methicillin)。1959年應用於臨床後曾有效地控製了金黃色葡萄球菌産酶株的感染，可時隔兩年，英國的jevons［1］就首次發現了耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(methicillin resistant staphylococcus aureus,mrsa),mrsa從發現至今感染幾乎遍及全球，已成為院內感染的重要病原菌之一。因此，開展對mrsa的檢測，對於控製醫院內感染的流行，指導臨床治療有着十分重要的意義。
mrsa的特性
1 不均一耐藥性［2］ mrsa菌落內細菌存在敏感和耐藥兩個亞群，即一株mrsa中衹有一小部分細菌約10－4～10－7，對甲氧西林高度耐藥，在50 μg/ml甲氧西林條件下尚能生存，而菌落中大多數細菌對甲氧西林敏感，在使用抗生素後的幾小時內大量敏感菌被殺死，但少數耐藥菌株卻緩慢生長，在數小時反又迅速增殖。
2 廣譜耐藥性 mrsa除對甲氧西林耐藥外，對其它所有與甲氧西林相同結構的β-內酰胺類和頭孢類抗生素均耐藥，mrsa還可通過改變抗生素作用靶位，産生修飾酶，降低膜通透性産生大量paba等不同機製［3］，對氨基糖苷類、大環內酯類、四環素類、氟喹喏酮類、磺胺類、利福平均産生不同程度的耐藥，唯對萬古黴素敏感。
3 生長特殊性 mrsa生長緩慢，在30°c，培養基ph 7.0及高滲(40 g/l nacl溶液)條件下生長較快［4］。在30°c時，不均一耐藥株表現為均一耐藥和高度耐藥，在37°c又恢復不均一耐藥。均一耐藥株在＞37°c或ph＜5.2時，均一耐藥性可被抑製而表現為敏感。增加nacl濃度，低溫孵育和延長時間，可使不均一耐藥株群體中敏感亞群中的耐藥性得到充分表達，即能耐受較高濃度的甲氧西林，而對其中耐藥亞群無影響［5］。但最近也有報道，高滲下延長培養時間，會影響mrsa的檢出結果，因為在高????情況下，培養48 h，對甲氧西林敏感的金黃色葡萄球菌(methicillin sensitive staphylococcus aureus;mssa)易産生大量β-內酰胺酶，可緩慢水解甲氧西林，導致細菌生長，而誤認為mssa。所以一般mrsa在高????環境孵育24 h，而耐甲氧西林凝固酶陰性葡萄球菌(mrcns)由於耐藥亞群菌數少於金葡菌，應孵育48小時觀察結果。
mrsa的耐藥機理
1 固有耐藥 是由染色體介導的耐藥，其耐藥性的産生與細菌産生一種青黴素結合蛋白(pbp)有關。産生五種pbp(1，2，3，3′和4)，它們具有合成細菌細胞壁的功能。它們與β-內酰胺類抗生素有很高的親和力，能共價結合於β-內酰胺類藥物的活動位點上，失去其活性導致細菌死亡，而mrsa産生了一種獨特的pbp，這種分子量增加了78～1000道爾頓的pbp，因其電泳率介於pbp2與pbp3之間，故稱為pbp2a或pbp2′［6］。pbp2a對β-內酰胺類抗生素親和力很低，因而很少或不被β-內酰胺類藥結合。在β-內酰胺類抗生素存在的情況下，細菌仍能生長，表現出耐藥性。pbp2a的産生是受染色體甲氧西林耐藥基因(mec a)來調節的。mrsa與mssa根本區別在於它們的pbp不同。
2 獲得性耐藥 是質粒介導的耐藥。某些菌株通過耐藥因子産生大量β-內酰胺酶，使耐酶青黴素緩慢失活，表現出耐藥性［7］，多為臨界耐藥。
mrsa的分型
mrsa分型對追蹤傳染源，研究型別與感染種類，耐藥性的關係有重要作用。國外開展較早的噬菌體分型，將待測菌於肉湯中，35°c孵育6 h，塗於分型瓊脂平板上，待幹後將23種噬菌體註入瓊脂平板中的小方格內，再置35°c孵育6 h後移至室溫過夜觀察結果。用4組23種噬菌體，將mrsa分為4群，一般以Ⅰ群為最多［8］，也有報告以Ⅲ群為多。噬菌體分型結果常不滿意，日本小粟 子證實有29.3%菌株不能分型，且重複性差，不宜用於流行病學調查。質粒圖譜分型較為可靠，可分為18個型，能準確地分析菌株之間的相關性，將流行菌株與非流行菌株加以區別。國內mrsa廣泛存在分子量為1.6 md、1.8 md及2.67 md的質粒，不同地區和不同醫院會有特殊質粒帶。免疫印跡分型法將mrsa分為9個型，以b、c型為最常見，各型含有特徵性的分子帶，該法比較穩定。染色體限製性內切酶分析可識別病原體dna鏈上特異位點及核苷酸序列，能從基因水平顯示病原體特徵，mrsa還可用血清學、凝固酶、耐藥譜等方法分型。現在southern印跡法也逐漸運用於mrsa的分型。
mrsa的檢測
由於mrsa的不均一耐藥性，給其檢測帶來一定的睏難。mrsa的檢出率受孵育溫度、時間、培養基的ph和nacl的濃度、菌液的數量等多種因素的影響。因此，目前還沒有一種最佳的檢測方法。
1 紙片擴散法(k-b法) 平皿中mh瓊脂厚度為4 mm，菌液調至0.5麥氏濁度，塗沫於上述平板，甲氧西林含量5 μg/片，35°c孵育24 h，抑菌圈≤11 mm為耐藥，≥17 mm為敏感，由於mrsa通常對其它耐酶半合成青黴素也耐藥，因此美國臨床實驗室標準化委員會(nccls)推薦用苯唑西林來代替檢測mrsa。苯唑西林在貯存過程中藥效不易降低，且對不均一耐藥性檢測效果更好，所以國內多數實驗室都采用苯唑西林，苯唑西林含量為1 μg/片，抑菌圈≤10 mm為耐藥，≥13 mm為敏感，11～12 mm為中介。質控菌株為金黃色葡萄球菌atcc 29213(耐藥菌株)，金黃色葡萄球菌atcc 25923(敏感菌株)。紙片擴散法最大優點是快速、簡便、價格便宜，易被檢驗人員接受。在合適的抗生素及培養溫度、菌液的濃度、培養基厚度等條件下，檢測mrsa是可行的。但leneastre等［9］對k-b法和特異性mec a基因dna片段法鑒定mrsa的結果進行了比較，發現在49株用k-b法鑒定為mssa的菌株，特異性mec a基因dna片段法鑒定卻有11株含mec a基因；59株用紙片法鑒定為典型mrsa的菌株，有10株卻沒有特異性mec a基因，這兩種方法大約有18%～20%的差異。chipman［10］等研究也表明以mec a基因檢測法為參考方法時，紙片擴散法的符合率為88.2%。這可能與紙片法中的瓊脂中沒有nacl成份，一些菌株的耐藥性得不到完全表達有關。因此，為提高紙片擴散法檢測mrsa的可靠性，最好在mh瓊脂中加入40 g/l nacl。
2 肉湯稀釋(mic)法 美國疾病控製中心(cdc)推薦用mh肉湯培養基加nacl至20 g/l濃度，同時加入ca,mg離子，將苯唑西林進行倍比稀釋，從0.125～16 μg/ml，菌濃度為104/ml，35°c孵育24 h，mic＜2 μg/ml為敏感，＞4 μg/ml為耐藥，該法檢出率可達95%，但操作較繁瑣。
3 瓊脂稀釋(mic)法 用含20 g/l nacl的mh瓊脂將苯唑西林倍比稀釋為12個不同濃度並澆註平皿。苯唑西林量終濃度為0.125～256 μg/ml。再將菌液(0.5麥氏濁度)點種於含藥平皿，35°c孵育24 h。該法適用於大量菌株的mrsa檢測，結果容易判斷，重複性好，但耗時，費力。
4 瓊脂篩選法 這是1997年nccls推薦的mrsa的確證試驗，即mh培養基加nacl(40 g/l)加苯唑西林(6 μg/ml)，將菌液(0.5麥氏濁度)點種或畫綫35°c孵育24 h，衹要平皿有菌生長，即使一個菌落也是mrsa，該法敏感度為100%，常用作校正其它方法的標準，尤其適用於檢測抑菌圈直徑處於中介度的金黃色葡萄球菌。
5 濃度梯度(etest)法 是1988年ab biodisk公司推出，在含20 g/l nacl的mh瓊脂平板上，貼上苯唑西林的試條，菌液調至0.5～1麥氏濁度，35°c孵育24 h，直接讀取mic值。mic＜2 μg/ml為敏感，＞4 μg/ml為耐藥。etest法結合了紙片擴散法和肉湯稀釋法的優點，長塑料條含有連續的呈指數梯度變化的苯唑西林(0.016～256 μg/ml)，故在檢測低水平或中等程度耐藥的mrsa時結果更為準確。novak［11］等報道，用alamar法和etest法對127株mrsa的檢測比較，兩者結果相關較高，用etest法檢測127株mrsa，其中93株mic＞256 μg/ml，28株在6～256 μg/ml，檢出率達96%，etest法具有精確、可靠、穩定性好的特點，但缺點是價格昂貴。
6 自動化藥敏檢測 目前有vitek係統、atb係統、microscan係統、sensiter aris等。將菌液稀釋後註入藥敏板或孔內，然後通過檢測菌液濁度，熒光指示劑的熒光強度或熒光底物的水解反應來判讀結果。其優點是快速，但有時對生長緩慢或延遲表達耐藥性的mrsa，在3～4 h內難以達到檢測水平，容易漏檢或誤報mrsa。
7 dna探針雜交 上述的方法都是檢測mrsa耐藥表型的方法。mrsa根據其耐藥頻率可分為1、2、3、4類，其耐藥頻率為10－7、10－4、10－3以及10－1［12］。上述常規的檢測方法對於3、4類mrsa一般不存在問題，但對於低頻率的1、2類則很容易造成漏檢。因此，對於低水平耐藥或臨界水平耐藥的mrsa，應選擇特異性高的分子生物學方法來檢測。dna探針雜交是用特異性的mec a dna片段經地高辛標記，與可疑菌株進行雜交，有學者報告［13］，dna探針僅與mrsa dna雜交，與mssa dna無雜交帶，其特異性高於瓊脂稀釋法，敏感性高於肉湯稀釋法，而且可直接用於臨床標本，無需先進行細菌分離培養，但探針較貴，保存期較短。
8 pcr技術 本世紀80年代末期，國外就有人用聚合酶鏈反應(pcr)來檢測pbp2a的mec a基因。它是根據金黃色葡萄球菌tk 784的mec a基因dna序列［14］設計一引物，再裂解提取被測菌的dna，在一定條件下進行擴增，經瓊脂糖電泳後在紫外燈下觀察有無與陽性對照菌株(金黃色葡萄球菌atcc29213)相同的區帶。pcr具有較高的靈敏度，衹要被測菌有微量的的基因，即出現陽性結果，因此常作為檢測mrsa的參考方法。陳秀樞實驗表明［14］，金黃色葡萄球菌耐苯唑西林的耐藥水平與mec a基因有較好的相關性。mic＞4 μg/ml的22株菌均檢出mec a基因。由於pcr很靈敏，有時會因實驗室的污染而出現假陽性，為使pcr具有更高的可靠性，必須對其擴增産物進行探針雜交或測序以提高特異性［15］。而有一些耐藥基因是沉默基因，不表達mec a基因産物，有時會得出假耐藥結論，所以分子生物學方法並非100%的敏感和特異，加上該法前期處理操作繁瑣，且需要一定的設備，僅在可疑或特殊情況下做此試驗。
mrsa感染的流行概況
自從1961年英國發現mrsa後，在歐美及亞洲一些國傢相繼報道了mrsa所致的院內感染。從60年代後期到80年代，mrsa感染率大大增加。美國nnis報道1975年182所醫院mrsa占金黃色葡萄球菌感染總數的2.4%，1991年上升至24.8%，其中尤以500張床以上的教學醫院和中心醫院為多，因為這些醫院裏mrsa感染的機會較多，耐藥菌株既可由感染病人帶入醫院，也可因濫用抗生素在醫院內産生［16］。歐洲1993年1417傢醫院icu分離的mrsa達60%［17］。而日本kansai醫科大學附屬醫院mrsa的分離率1993年達到41%。國內在70年代發現有mrsa，近幾年mrsa的檢出率正在逐年上升，上海1978年在200株金黃色葡萄球菌中mrsa衹占5%，1988年上升至24%，1996年激增至72%［18］。天津1988年調查mrsa分離率為47%［19］，北京醫科大學附屬醫院1996年分離mrsa達58.3%［20］，山東淮坊市1996年在三傢醫院的嬰兒室分離出金黃色葡萄球菌198株，其中mrsa為112株(56.5%)［21］。武漢同濟醫科大學附院1992年分離mrsa就達79.6%［22］。mrsa感染多發生於免疫缺陷者，大面積燒傷，大手術後患者，長期住院及老年患者，mrsa極易導致感染的流行和暴發。mrsa傳播主要通過醫護人員的手，在患者、醫護人員、患者間播散，另外，衣物、敷料等物品可攜帶mrsa，促進mrsa在院內的流行，病人一旦感染或攜帶mrsa，該菌可存在於患者身上達數月之久。
mrsa的治療和預防
1 mrsa的治療 mrsa感染的治療是臨床十分棘手的難題之一，關鍵是其對許多抗生素有多重耐藥，萬古黴素是目前臨床上治療mrsa唯一療效肯定的抗生素［23］。應用30多年來未發現耐藥菌株。因為萬古黴素是三環糖肽類抗生素，其具有抑製細胞壁合成，破壞細胞膜及阻礙細菌rna合成的多種作用。1996年日本報道第一例對萬古黴素中度敏感(mic=8 μg/ml)的金黃色葡萄球菌。1997年美國也從一個腹膜炎患者分離出對萬古黴素中度敏感的金黃色葡萄球菌［24］。nccls規定：萬古黴素敏感≤4 μg/ml，中介8～16 μg/ml，耐藥≥32 μg/ml，而世界上到目前為止還未檢測到一株mic＞32 μg/ml的金黃色葡萄球菌。但是隨着萬古黴素的廣泛使用，相信不久就會出現耐萬古黴素的mrsa，因此現在就必須適量地慎用萬古黴素。除萬古黴素外，還有壁黴素、香豆黴素等新藥對mrsa有較強的抗菌活性。另外，萬古黴素也可與磷黴素、利福平、氨基糖苷類、喹諾酮類藥物合用，加強治療效果。
2 mrsa預防 首先是合理使用抗生素。目前臨床濫用抗生素的現象，對mrsa的流行起了一定的擴散作用，因此，在選擇抗生素時應慎重，以免産生mrsa菌株，如對大手術後預防深部葡萄球菌感染，使用第一代和第二代頭孢菌素為好(如頭孢唑啉、頭孢呋肟等)，第三代頭孢菌素抗葡萄球菌效果反而不如第一代效果好。第三代頭孢菌素的長期使用與mrsa的出現率呈平行關係。
3 早期檢出帶菌者 醫院應加強對新入院及mrsa易感者的檢查，尤其是燒傷病區、icu、呼吸病房、血液科和小兒科的病人。同時細菌室應選用準確的檢測手段，發現mrsa，及時嚮臨床報告，以便控製感染和隔離治療。
.4 加強消毒制度 醫護人員檢查病人前後要嚴格洗手消毒，有條件應用一次性口罩、帽子、手套，醫療用品要固定，以防院內交叉感染。 | | 耐甲氧西林金黃色葡萄球菌
屬MRSA是引起醫院感染的重要病源之一，除對甲氧西林耐藥外，還對臨床上廣泛應用的多種抗生素耐藥，所致感染呈散發或爆發流行，治療睏難，病死率高，是臨床治療上的一大難題。由MRSA引起的感染已遍及全世界。國內MRSA感染有增高趨勢，占金黃色葡萄球菌的5%～47%。
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