葉緑素熒光作為光合作用研究的探針，得到了廣泛的研究和應用。葉緑素熒光不僅能反映光能吸收、激發能傳遞和光化學反應等光合作用的原初反應過程，而且與電子傳遞、質子梯度的建立及atp合成和co2固定等過程有關。幾乎所有光合作用過程的變化均可通過葉緑素熒光反映出來，而熒光測定技術不需破碎細胞，不傷害生物體，因此通過研究葉緑素熒光來間接研究光合作用的變化是一種簡便、快捷、可靠的方法。目前，葉緑素熒光在光合作用、植物脅迫生理學、水生生物學、海洋學和遙感等方面得到了廣泛的應用。
1葉緑素熒光的研究歷史
葉緑素熒光現象是由傳教士brewster首次發現的。1834年brewster發現，當一束強太陽光穿過月桂葉子的乙醇提取液時，溶液的顔色變成了緑色的互補色¬¬——紅色，而且顔色隨溶液的厚度而變化，這是歷史上對葉緑素熒光及其重吸收現象的首次記載。後來，stokes（1852）認識到這是一種光發射現象，並使用了“fluorescence”一詞。1874年，müller發現葉緑素溶液稀釋後，熒光強度比活體葉子的熒光強得多。儘管müller提出葉緑素熒光和光合作用之間可能存在相反的關係，但由於他的實驗沒有對照，實驗條件控製不嚴格，因此人們並沒有將葉緑素熒光誘導（瞬變）現象的發現歸功於müller。
kautsky是公認的葉緑素熒光誘導現象的發現者。1931年，kautsky和hirsch用肉眼觀察並記錄了葉緑素熒光誘導現象(lichtenthaler，1992；govindjee，1995)。他們將暗適應的葉子照光後，發現葉緑素熒光強度隨時間而變化，並與co2的固定有關（圖3.1）。他們得到的主要結論如下：1）葉緑素熒光迅速升高到最高點，然後下降，最終達到一穩定狀態，整個過程在幾分鐘內完成。2）麯綫的上升反映了光合作用的原初光化學反應，不受溫度（0℃和30℃）和hcn處理的影響。若在最高點時關掉光，則熒光迅速下降。3）熒光強度的變化與co2的固定呈相反的關係，若熒光強度下降，則co2固定增加。這說明當熒光強度降低時，較多的光能用於轉變成化學能。4）奇怪的是（照光後）co2的固定有一個延滯期，似乎說明“光依賴”的過程對co2固定過程的進行是必需的。另一個未得到解釋的現象是若在熒光誘導結束後關掉光，則熒光水平的恢復需要很長時間。在kautsky的發現之後，人們對葉緑素熒光誘導現象進行了廣泛而深入的研究，並逐步形成了光合作用熒光誘導理論，被廣泛應用於光合作用研究。由於kautsky的傑出貢獻，葉緑素熒光誘導現象也被稱為kautsky效應（kautsky effect）。
2葉緑素熒光的産生及其量子産量
細胞內的葉緑素分子通過直接吸收光量子或間接通過捕光色素吸收光量子得到能量後，從基態（低能態）躍遷到激發態（高能態）。由於波長越短能量越高，故葉緑素分子吸收紅光後，電子躍遷到最低激發態；吸收藍光後，電子躍遷到比吸收紅光更高的能級（較高激發態）。處於較高激發態的葉緑素分子很不穩定，在幾百飛秒（fs，1 fs=10－15 s）內，通過振動弛豫嚮周圍環境輻射熱量，回到最低激發態（圖3.2）。最低激發態的葉緑素分子可以穩定存在幾納秒（ns，1 ns=10－9 s）。
處於較低激發態的葉緑素分子可以通過幾種途徑釋放能量回到穩定的基態。能量的釋放方式有如下幾種（圖3.3）（campbell et al.，1998；roháček & barták，1999；malkin & niyogi，2000）：1）重新放出一個光子，回到基態，即産生熒光。由於部分激發能在放出熒光光子之前以熱的形式逸散掉了，因此熒光的波長比吸收光的波長長，葉緑素熒光一般位於紅光區。2）不放出光子，直接以熱的形式耗散掉（非輻射能量耗散）。3）將能量從一個葉緑素分子傳遞到鄰近的另一個葉緑素分子，能量在一係列葉緑素分子之間傳遞，最後到達反應中心，反應中心葉緑素分子通過電荷分離將能量傳遞給電子受體，從而進行光化學反應。以上這3個過程是相互競爭的，往往是具有最大速率的過程處於支配地位。對許多色素分子來說，熒光發生在納秒級，而光化學發生在ps級，因此當光合生物處於正常的生理狀態時，天綫色素吸收的光能絶大部分用來進行光化學反應，熒光衹占很小的一部分。
活體細胞內由於激發能從葉緑素b到葉緑素a的傳遞幾乎達到100％的效率，因此檢測不到葉緑素b熒光。在室溫下，絶大部分（約90％）的活體葉緑素熒光來自psⅡ的天綫色素係統，而且光合器官吸收的能量衹有約3%～5%用於産生熒光（林世青，1996；krause & weis，1991）。
3 調製葉緑素熒光
調製葉緑素熒光全稱脈衝-振幅-調製（pulse-amplitude-modulation,pam）葉緑素熒光，我們國內一般簡稱調製葉緑素熒光，測量調製葉緑素熒光的儀器叫調製熒光儀，或叫pam。
調製葉緑素熒光（pam）是研究光合作用的強大工具，與光合放氧、氣體交換並稱為光合作用測量的三大技術。由於其測量快速、簡單、可靠、且測量過程對樣品生長基本無影響，目前已成為光合作用領域發表文獻最多的技術。
4 調製葉緑素熒光儀的工作原理
1983年，walz公司首席科學家，德國烏茲堡大學教授ulrich schreiber博士利用調製技術和飽和脈衝技術，設計製造了全世界第一臺脈衝振幅調製（pulse-amplitude-modulation，pam）熒光儀——pam-101/102/103。
所謂調製技術，就是說用於激發熒光的測量光具有一定的調製（開/關）頻率，檢測器衹記錄與測量光同頻的熒光，因此調製熒光儀允許測量所有生理狀態下的熒光，包括背景光很強時。正是由於調製技術的出現，纔使得葉緑素熒光由傳統的“黑匣子”（避免環境光）測量走嚮了野外環境光下測量，由生理學走嚮了生態學。
所謂飽和脈衝技術，就是打開一個持續時間很短（一般小於1 s）的強光關閉所有的電子門（光合作用被暫時抑製），從而使葉緑素熒光達到最大。飽和脈衝（saturation pulse, sp）可被看作是光化光的一個特例。光化光越強，ps ii釋放的電子越多，pq處纍積的電子越多，也就是說關閉態的電子門越多，f越高。當光化光達到使所有的電子門都關閉（不能進行光合作用）的強度時，就稱之為飽和脈衝。
打開飽和脈衝時，本來處於開放態的電子門將該用於光合作用的能量轉化為了葉緑素熒光和熱，f達到最大值。
經過充分暗適應後，所有電子門均處於開放態，打開測量光得到fo，此時給出一個飽和脈衝，所有的電子門就都將該用於光合作用的能量轉化為了熒光和熱，此時得到的葉緑素熒光為fm。根據fm和fo可以計算出ps ii的最大量子産量fv/fm=(fm-fo)/fm，它反映了植物的潛在最大光合能力。
在光照下光合作用進行時，衹有部分電子門處於開放態。如果給出一個飽和脈衝，本來處於開放態的電子門將該用於光合作用的能量轉化為了葉緑素熒光和熱，此時得到的葉緑素熒光為fm’。根據fm’和f可以求出在當前的光照狀態下ps ii的實際量子産量yield=Φpsii=Δf/fm’=(fm’-f)/fm’，它反映了植物目前的實際光合效率。
在光照下光合作用進行時，衹有部分電子門處於關閉態，實時熒光f比fm要低，也就是說發生了熒光淬滅（quenching）。植物吸收的光能衹有3條去路：光合作用、葉緑素熒光和熱。根據能量守恆：1＝光合作用＋葉緑素熒光＋熱。可以得出：葉緑素熒光＝1－光合作用－熱。也就是說，葉緑素熒光産量的下降（淬滅）有可能是由光合作用的增加或熱耗散的增加引起的。由光合作用的引起的熒光淬滅稱之為光化學淬滅（photochemical quenching, qp）；由熱耗散引起的熒光淬滅稱之為非光化學淬滅（non-photochemical quenching, qn或npq）。光化學淬滅反映了植物光合活性的高低；非光化學淬滅反映了植物耗散過剩光能為熱的能力，也就是光保護能力。
光照狀態下打開飽和脈衝時，電子門被完全關閉，光合作用被暫時抑製，也就是說光化學淬滅被全部抑製，但此時熒光值還是比fm低，也就是說還存在熒光淬滅，這些剩餘的熒光淬滅即為非光化學淬滅。淬滅係數的計算公式為：qp=(fm’-fs)/fv’=1-(fs-fo’)/(fm’-fo’)；qn=(fv-fv’)/fv=1-(fm’-fo’)/(fm-fo)；npq=(fm-fm’)/fm’=fm/fm’-1。
當f達到穩態後關閉光化光，同時打開遠紅光（far-red light, fl）（約持續3－5 s），促進ps i迅速吸收纍積在電子門處的電子，使電子門在很短的時間內回到開放態，f回到最小熒光fo附近，此時得到的熒光為fo’。由於在野外測量fo’不方便，因此野外版的調製熒光儀（除pam-2100和water-pam）外，多數不配置遠紅光。此時可以直接利用fo代替fo’來計算qp和qn，儘管得到的參數值有輕微差異，但qp和qn的變化趨勢與利用fo’計算時是一致的。由於npq的計算不需fo’，近10幾年來得到了越來越廣泛的應用。
根據ps ii的實際量子産量Δf/fm’和光合有效輻射（photosynthetically active radiation, par）還可計算出光合電子傳遞的相對速率retr=Δf/fm’•par•0.84•0.5。其中0.84是植物的經驗性吸光係數，0.5是假設植物吸收的光能被兩個光係統均分。
5 著名調製葉緑素熒光儀簡介
pam-101/102/103，最經典的型號，雖已停産，但在國際最著名的光合作用實驗室，仍是主打機型，原因很簡單，它老不壞啊，呵呵
pam-2000/pam-2100，最暢銷的便攜式機型，應用非常廣泛
mini-pam，比pam-2100便宜，功能同樣強大
diving-pam，全球第一臺可水下原位測量植物生理的儀器，儀器全防水設計，在珊瑚研究領域應用非常廣泛
imaging-pam，新型熒光成像係統，最有意思的是一個主機可以連接多個探頭，功能超級強大，是“下一代”産品
dual-pam-100，同步測量葉緑素熒光和p700，也就是同時研究psii和psi活性，在技術上有重大革新
等等 |